人间充质干细胞无血清培养基

重庆市华雅干细胞技术有限公司的干细胞研究产品主要包括：生长因子、通路调控因子、干细胞培养基、细胞株等，并且在仓库备有人间充质干细胞无血清培养基现货。欢迎新老客户：   

    Human MSC medium (Chemically-Defined) 人间充质干细胞无血清培养基间充质干细胞具有光明的临床治疗前景。然而，常用培养基含有胎牛血清（FBS），增加了病原体、异种抗原、批间不稳定性。美国FDA正考虑禁止使用FBS于细胞治疗。提供的Human MSC medium ( Chemically-Defined )，是一种无血清、无异种蛋白、化学成分明确的人间充质干细胞培养基，且无需昂贵的铺板蛋白，生长分化更优于血清培养基。
    该培养基是为扩增从骨髓、脐带血或脂肪组织提取的人类间充质干细胞而设计的无血清培养基。它化学成分明确，所有组分为化学合成或重组纯化的蛋白。它无异源蛋白，不含直接从任何动物组织提取成份。因此它不存在批间误差和潜在的动物源性病原体。如果配合使用特定的培养板，还可以省去铺板的工序和时间，免去铺板胶的费用。
本产品组成及保存Human MSC medium (Chemically-Defined)（ 人间充质干细胞无血清培养基货号MGro-500）
产品组成：

产品组成           规格      储存                     保质期      
 
基础液           450ml        2 ‐ 8°C, 避光保存      6个月

添加物            50ml       ‐ 80°C, 避光保存        6个月
 

重庆市华雅干细胞技术有限公公司还可以提供：其它所需试剂：
? L‐谷氨酸盐（L‐Glutamine),或同类产品；
? 选择不铺板：建议使用BD公司的培养板或 Corning公司的培养板
? 选择铺板：Fibronectin或同类产品；
? 胰酶Trypsin 0.05%/0.53mM EDTA或同类产品；
培养基配制：
1.解冻添加物。建议2‐8°C解冻。解冻后的溶液可以分装，于‐80°C保存，尽量避免反复冻融。
2.配制100ml人间充质干细胞*培养基，需在无菌条件下添加10ml添加物于90ml基础液中，再加入1ml 200mM L‐谷氨酸盐；
3.如果需要也可加入抗菌素（自选）。
    配制好的*培养液（包含基础液、补充液、谷氨酸盐）2‐8°C避光保存，保存期为1个月。从其它培养基向本产品逐渐培养于其它无血清或有血清培养基的MSCs可以快捷方便地转换到该产品培养。多数情况下，直接转换便可。个别情况下，可能需要逐步转换，如20%, 40%,依次递增。
复苏hMSCs细胞：
1.37°C水浴快速复苏冻融细胞。
2.将细胞转移到50ml离心管中。
3.逐滴向装有1ml细胞液的离心管中加入10ml预先复温的人间充质干细胞*培养基，注意边加边轻轻晃动离心管。
4.将上述混合溶液转移到细胞培养瓶或细胞培养板中。或者可250xg（～1200rpm）离心10min，再用*培养基重悬后再转移到细胞培养板中。
5.在4-6%CO2，36‐38°C培养箱孵化。
6.孵化24h，换一次培养液。
7.此后每隔2天换一次液，直到传代培养。
传代培养：
    当使用特定的细胞培养板，如BD PrimariaTM系列或corning CellBINDTM系列时，使用该培养基是不需要预先铺板。传统的细胞培养瓶和培养板正在评估中。对于那些还没有被评估的产品或不适用于不预先铺板工序的产品，推荐使用Fibronectin进行铺板。
1.在镜下观察细胞，确定传代的时间。为了保证MSCs的生长潜力，推荐在细胞量达到70%满的时候传代。如果细胞量达到80%以上满时，细胞在传代之后可能出现停止增殖的现象。切记，在任何情况下，不要让细胞超出80%满！
2.预先将0.05%胰酶和*培养基复温到37°C待用。
3.用移液枪吸走旧培养基。
4.用DPBS洗一遍（自选）。
5.加入0.05%胰酶以覆盖住细胞表面，推荐室温消化细胞（消化液用量：6孔板每一孔约10cm2加入0.5ml，25cm2培养板加入1ml）。
6.镜下观察细胞，当看见细胞开始从培养板剥离，轻轻敲击培养板边缘帮助细胞脱落。消化时间为1‐3分钟。注意，消化时间会比在有血清的培养基中培养的细胞要短。当所有细胞都脱落时，快速采取以下步骤。（不要在所有细胞都脱落后，保持在胰酶中太长时间，因为这样会影响MSCs以后的生长状态）。
7.加入2倍于消化液的*培养基，将细胞悬液收集于15ml离心管中。（如果是使用胰酶消化细胞，可以使用大豆酶抑制剂来终止胰酶。尤其是当以下步骤8洗细胞不能在10分钟内被完成的情况下，这一步是非常必要的。原因是这类无血清培养基中都不含抗胰蛋白酶。除非快速离心分离，否则培养基中留存的胰蛋白酶会破坏细胞并影响其生长能力。）
8.1200rpm离心10分钟。
9.尽量弃去离心后的上层清液。用*培养基重悬细胞。此时可取细胞悬液进行细胞计数。
10.按照3~5X103细胞量/cm2接种细胞。上下左右轻轻摇匀细胞以保证细胞在培养板里的均匀分布。细胞接种密度：6孔板每一孔约10cm2约3~5X104细胞，25cm2培养板约0.75~1.25X105细胞。
11.4~6%CO2，37°C培养。
12.每隔2天换新鲜的*培养基。
13.当细胞量达到70%满时，传代（一般每隔3-4天）。
冻存细胞:
1.配制细胞冻存液：90%*培养液 + 10%DMSO。
2.离心分离细胞，用冻存液重悬细胞，使细胞密度为1~5x106/ml，转移到冻存管中。
3.将冻存管转移到冻存盒中，依次置于4度-负20度- 负80度冰箱。
4.将细胞转移到液氮罐中长期贮存。
仅供研究研究使用，不用于人的诊断及治疗。

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