目前，神经干细胞的分离方法主要有三种：无血清培养基自然筛选法、流失细胞术分选法、免疫磁珠分选法。我司采用的是神经干细胞培养基的自然筛选法。

　　神经干细胞培养基自然筛选法是迄今应用，也是zui简单和容易操作且行之有效的方法。其原理是利用特殊的培养基使成熟的神经细胞无法较长时间地成活，而分离筛选出能够在该培养条件下存活并增殖的神经干细胞群体。首先将含神经干细胞的神经组织通过机械或酶解分散等方法制备成单细胞，然后培养于含有特殊营养添加剂和促增殖因子的不含血清的培养液中。非神经干细胞在这种培养系统中由于营养缺陷无法较长时间地存活，而神经干细胞则适应该培养体系并在促增殖因子作用下生长增殖。因此，经过培养一段时间之后，就可获得通过这种自然筛选而增殖形成的呈神经球状生长的神经干细胞群体。这种利用特殊培养基自然筛选神经干细胞方法的优点是：简便易行，不需要特殊的仪器设备等条件，分离效率高，神经干细胞损伤小易于成活。

　　我公司分离培养神经干细胞的步骤大致如下：

　　（1） 取胎脑。

　　（2） 加Trypsin/EDTA消化，用吸管吹吸使细胞均匀分散均匀。

　　（3） 离心除去Trypsin/EDTA。

　　（4） 加神经干细胞*培养基培养。

　　当神经球较大或出现细胞贴壁分化时应及时传代。传代经过大致为：去除培养液；PBS洗涤；Trypsin/EDTA消化；离心，去上清；神经干细胞*培养基重悬；按比例接种。神经干细胞的体外培养，选用合适的体外培养条件至关重要。目前，神经干细胞培养常规使用的培养基为DEME/F12（1:1）加上无血清营养添加剂B27和碱性成纤维细胞生长因子,也有应用添加剂N2或表皮生长因子等。在此培养体系中神经干细胞呈神经球状生长，即增殖的细胞不贴附于培养器皿上，而是圆形的细胞彼此黏附在一起形成小球状悬浮于培养液中生长。当采用一些方法将其分散成单细胞后，既可由单个细胞增殖成神经球，也可由数个细胞重聚集后形成小神经球结构，然后小神经球再增殖成较大的神经球。这些神经球中，外周的细胞为新增殖的细胞，生长较为旺盛，而在神经球中央，特别是直径较大的神经球可见到有一些细胞出现凋亡或坏死，有部分可发生自主分化，表现为带短突起的细胞。所以，当神经球长到一定大小要及时传代。要维持神经干细胞在体外生长，在培养体系中需要加入丝裂原来促进其增殖，大多数采用bFGF。适当浓度的bFGF可使神经干细胞的增殖能力达到zui大，但高浓度却会促进神经干细胞的分化。

　　神经干细胞在体外培养另外很重要的一点就是如何尽量让其少分化或不分化，除了神经干细胞本身的特性决定了一部分不对称分裂的细胞必将发生自主分化外，培养条件对神经干细胞的分化与否影响很大，比如在培养中发现，将神经干细胞球培养于塑料器皿，其黏附于器皿表面并发生分化的可能要比培养于玻璃器皿的高很多。另外，某些底物如多聚赖氨酸或多聚尿氨酸、作为细胞外基质的的层黏脸蛋白、胶原等都能在无特殊诱导剂存在的情况下，促进神经干细胞的贴壁而分化。神经干细胞在体外分化的形态表现为由圆形变成带有明显突起、形态各异的神经细胞，悬浮的神经球出现贴壁呈圆盘状，形态各异的细胞向周围呈放射状长出并迁移，甚至全部细胞均分化平铺于器皿上生长。培养液中bFGF除了对神经干细胞的分裂增殖起着关键的作用外，对神经干细胞分化的作用也很重要。当培养液中撤除bFGF时能够导致神经干细胞的分化，但较高浓度的bFGF却也能促进神经干细胞的分化。