造血干细胞培养基的培养步骤

1、胚胎成纤维细胞的复苏：胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。

2、滋养细胞层的制备：把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿

中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）。一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可

用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。

3、小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏

4、小鼠胚胎干细胞的传代

5、小鼠胚胎干细胞的冻存

造血干细胞培养基的培养注意事项：

1、丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。

2、ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格

3、ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。

4、为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。