【科普】临床转录组测序

技术背景

随着基因组学技术的飞速发展，转录组学作为连接基因组与蛋白组的关键桥梁，在孟德尔疾病的临床诊断中发挥着日益重要的作用。转录组是指某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合，而转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）就是用高通量测序技术对转录组进行测序分析，反映样本中信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（ncRNA）的表达情况。其中针对mRNA的RNA-seq是最·常用的转录组学技术之一，也是在转录组水平上分析差异基因表达、mRNA可变剪切和等位基因失衡等问题不·可缺少的工具。

尽管在孟德尔遗传病的辅助诊断中，全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）已广泛应用，但仍存在20%–50%的病例无法明确诊断。而RNA-seq能够通过发现深度内含子突变、剪接异常、表达量变化等DNA层面难以捕捉的信息，提高2%~7.5%的遗传诊断率，对基于DNA的NGS方法（WES、WGS）提供的信息进行补充和扩展。

技术流程

1. Total RNA抽提

高质量的 RNA 是整个实验成功的基础，因此需要先对抽提总RNA进行质检，大致内容包括：RNA是否有污染及其降解程度、RNA的纯度（OD260/280）、RNA的浓度、RNA的完整性等。

2. 文库构建

得到质检合格的RNA后，进行测序文库的构建。首先需要通过磁珠吸附或其它手段富集mRNA；将富集到的mRNA打断至二代测序要求的长度并反转录成cDNA；之后经过末端修复、3’加A尾、连接接头、PCR富集等过程完成测序文库的构建。

3. 上机测序

构建的文库质检合格后，通过桥式PCR和可逆终止物测序（illumina平台）获得下机原始数据。

4. 数据分析

对下机数据进行过滤，筛选出高质量的数据，通过组间比较（需要设置对照组样本）着重分析患者样本中的差异表达基因和差异可变剪切。

技术优势

目前NGS应用孟德尔遗传病的辅助诊断中主要是基于DNA层面的检测（WES、WGS），导致许多类型的突变（如：结构变异、位于基因组非编码和调控区域的致病突变、可变剪切、同义突变等）存在漏检的情况，并且单从DNA层面很难对那些意义未明（VUS）的突变，以及一些误判为“良性"的突变进行解释。而RNA-seq有助于上述罕见突变的检出，并从RNA层面补充和扩展基于 DNA 的 NGS 方法提供的辅助诊断信息。

文献支持

一项研究通过83名WES和WGS未明确诊断的疑似患有孟德尔遗传病患者进行RNA-seq检测，确诊了14名患者（17%）。这表明RNA-seq可以对WES、WGS等检测方法进行补充，提高疾病检出率，并克服基于DNA层面的基因检测工具的部分局限性。

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