NK细胞培养基的培养方法需结合细胞来源、培养体系及目标需求设计，核心步骤涵盖培养基配制、细胞分离与接种、动态培养管理三大模块，以下为具体说明：
一、培养基配制与预处理
基础培养基选择
常用RPMI-1640、DMEM或X-VIVO15等无血清培养基，需添加5%-10%自体血浆或人AB型血清（灭活处理）。例如，X-VIVO15培养基中需补充5%血清，并加入200U/mLIL-2、10ng/mLIL-15及处理的K562细胞。
生长因子组合
核心因子包括IL-2（促进增殖）、IL-15（维持存活）、IL-12（增强抗原敏感性）及IL-21（提升细胞毒性）。例如，HER2单抗诱导体系中，需添加1000-2000IU/mLIL-2、20-40ng/mLIL-12、60-100ng/mLIL-15、30-60ng/mLIL-18。
包被处理
培养容器需提前包被抗CD3抗体或HER2单抗（如1-3mg/mL曲妥珠单抗，37℃包被1-2小时），以增强细胞黏附与激活效率。
二、细胞分离与接种
外周血来源NK细胞分离
通过Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，洗涤后重悬于含5%血清的培养基中，调整细胞密度至1×10⁶cells/mL。
脐带血来源NK细胞分选
使用CD34阳性选择磁珠分离造血干细胞/祖细胞，接种于含20ng/mLSCF、10ng/mLIL-15、10ng/mLFLT3L、20ng/mLIL-7的造血干细胞分化培养基中，诱导分化为NK细胞。
接种密度控制
初始接种密度建议为1.5-2×10⁶cells/mL，培养体积根据容器调整（如T75培养瓶终体积25mL，细胞培养袋终体积750-1500mL）。
三、动态培养管理
培养条件
温度37℃、5%CO₂、饱和湿度，每2-3天更换一半体积培养基，补充细胞因子与灭活血浆。例如，第7天转袋后需加入含1000-2000IU/mLIL-2和20-50ng/mLIL-21的培养基。
细胞扩增与监测
培养14-21天，期间每2-3天进行细胞计数与形态观察。第10天后按1.5倍补加培养基，第14-15天可收获1×10⁹-2×10⁹cells的NK细胞。
质量控制
培养第13天需检测细菌、内毒素与支原体，收获前通过流式细胞术鉴定表型（如CD56⁺CD3⁻）。若增殖停滞，可加入优化剂（如25μL/100mL培养基）。
