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细胞适应干细胞无血清培养基的方法
点击次数:698 更新时间:2019-01-16
众所皆知干细胞无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。 用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时,多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长;而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时,由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白,细胞往往以悬浮形式生长。
1.直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到干细胞无血清培养基(SFM)中。
一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应干细胞无血清培养基。对于直接适应,接种细胞密度应该:2.5×10~3.5×10细胞/ml。当细胞密度达到1×10~3×10细胞/ml时,传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×10~4×10细胞/ml时,细胞*适应了干细胞无血清培养基。每隔3~5天,当细胞密度达到1×10~3×10细胞/ml,细胞活率在90%时,贮备的适应了干细胞无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
2.连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到干细胞无血清培养基(SFM)中,与直接适应相比较,连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
(1)以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基:25%SFM 混合培养基中,传代培养。
(2)当细胞密度>5×10细胞/ml时,以2×10到3×10细胞/ml细胞密度,在有血清培养基:SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。
(3)以2×10到3×10细胞/ml细胞密度,25%有血清培养基和75% SFM中传代培养。
(4)当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml(接种后4到6天),在100%SFM培养基中传代培养。
(5)每隔3到5天,当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml,细胞活率在90%时,贮备的适应了干细胞无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物,直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前,可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。
在适应过程中,不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意,与有血清培养基相比,大部分SFM包含非常少的蛋白质,因而更易于受外界因素的影响。
细胞培养适应替代血清:许多细胞利用连续适应方法能很好的适应,用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1(v∶v)的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式,连续几代减少当前培养基的量:1∶2,1∶4,1∶16和100%替代培养基。每次适应改变血清比例时,传代细胞2到3次。
培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清,生长的延迟可能会发生,4允许进行2到3次的传代,使生长率恢复到以前的水平。
特别需要强调的是:配制无血清培养液必须使用高质量的水,如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为干细胞无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子,既便水中的有毒物质含量甚微,也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。
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